Απομόνωση DNA/RNA και σύνθεση cDNA

Η διεξαγωγή των μοριακών τεχνικών βασίζεται στην αξιοποίηση του γενετικού υλικού (DNA ή RNA) το οποίο απομονώνεται από τα κύτταρα του προσληφθέντος δείγματος (περιφερικό αίμα, μυελός, βιοψίες, επιχρίσματα). Η σύσταση του DNA και του RNA, καθώς και η διαδικασία απομόνωσης τους, είναι διαφορετικές και η επιλογή εξαρτάται από το είδος της εξέτασης που θα ζητηθεί. Οι βασικές τους διαφορές έγκεινται πρώτον στην σταθερότητα τους σαν μόρια και δεύτερον στην σύσταση εξωνίων και ιντρονίων. Το DNA αποτελεί ένα αρκετά σταθερό μόριο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί απευθείας στις μοριακές τεχνικές και περιλαμβάνει τόσο τα εξώνια όσο και τα ιντρόνια που περιέχονται στο γενετικό υλικό των κυττάρων. Για το λόγο αυτό αποτελεί κατάλληλο υλικό για την ανίχνευση μεταλλάξεων. Αντίθετα το RNA αποτελεί ένα ασταθές μόριο και απαιτείται αρχικά η αντίστροφη μεταγραφή του σε cDNA (συμπληρωματικό DNA) προκειμένου να μπορεί να χρησιμοποιηθεί περαιτέρω. To RNA περιλαμβάνει μόνο τα εξώνια και είναι κατάλληλο για την ανίχνευση υβριδικών μεταγράφων και τον προσδιορισμό της έκφρασης των γονιδίων.

Ο μοριακός έλεγχος στα αιματολογικά νεοπλάσματα συνηθέστερα γίνεται σε δείγματα μυελού των οστών ή περιφερικού αίματος. Για την ανάλυση απαιτούνται 3 έως 10 ml δείγματος σε EDTA. Το περιφερικό αίμα είναι κατάλληλο ως υλικό εξέτασης εάν εντοπίζονται σε αυτό κακοήθη κύτταρα. Σε αντίθετη περίπτωση, καταλληλότερο υλικό είναι ο μυελός των οστών. Λοιπά δείγματα όπως εγκεφαλονωτιαίο υγρό, πλευριτικές συλλογές, βιοψίες ή επιχρίσματα μυελού των οστών, μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για την απομόνωση γενετικού υλικού με τον περιορισμό ότι στα αρχειακά υλικά δεν είναι δυνατή η απομόνωση RNA.

PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης)

Η τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) αποτελεί την βάση των μοριακών τεχνικών. Ουσιαστικά αυτό που κάνει είναι μία επαναλαμβανόμενη αντιγραφή ενός γονιδίου στόχου προκειμένου αυτό να ενισχυθεί επαρκώς ώστε να μπορεί να είναι ανιχνεύσιμο. Αξιοποιεί τη φυσιολογική δράση του ενζύμου της πολυμεράσης η οποία κάτω από κατάλληλες συνθήκες και θερμοκρασίες προσδένεται σε μονόκλωνο DNA και ξεκινάει την διαδικασία της αντιγραφής του. Το σημείο στόχος ορίζεται από τους κατάλληλους εκκινητές που οριοθετούν την αρχή και το τέλος που θα αντιγραφεί. Οι εκκινητές είναι ολιγονουκλεοτιδικές αλληλουχίες που σχεδιάζονται κατάλληλα ώστε να υβριδίζονται εκατέρωθεν της περιοχής στόχου. Η διαδικασία του υβριδισμού των εκκινητών, της πρόσδεσης της πολυμεράσης και της αντιγραφής της μονόκλωνης έλικας DNA, επαναλαμβάνεται 30-50 φορές, ανάλογα της εξέτασης, όπου μετά από κάθε κύκλο PCR τα προϊόντα διπλασιάζονται. Στο τελος της PCR έχουμε χιλιάδες αντίγραφα του γονιδίου στόχου. Τα προϊόντα αυτά οπτικοποιούνται μέσω τριχοειδικής ηλεκτροφόρησης όπου κινούνται δια μέσου ενός λεπτού τριχοειδούς με πολυμερές. Η ταχύτητα κίνησης εξαρτάται από το μήκος του κάθε προϊόντος. Τα προϊόντα αναλύονται ως προς το μέγεθός τους σε σύγκριση με ένα εσωτερικό πρότυπο. Η παρουσία ενός PCR προϊόντος στο αναμενόμενο μέγεθος υποδεικνύει την παρουσίας του γονιδίου στόχου.

Real-Time PCR (PCR σε πραγματικό χρόνο)

Η Real-Time PCR (PCR σε πραγματικό χρόνο) αποτελεί μία παραλλαγή της απλή PCR όπου τα προϊόντα που προκύπτουν μετά από κάθε κύκλο PCR αναλύονται σε πραγματικό χρόνο. Αυτό επιτυγχάνεται χάρη στην παρουσία φθοριζόντων ανιχνευτών που υβριδίζονται πάνω στην περιοχή στόχος. Μετά από κάθε κύκλο PCR τα προϊόντα διπλασιάζονται επομένως και ο φθορισμός. Η ανίχνευση της έντασης του φθορισμού αναλύεται μέσω ειδικής οπτικής μονάδας. Η παρουσία καμπύλης φθορισμού υποδεικνύει την παρουσία του γονιδίου στόχου.

Η Real-Time PCR έχει τη δυνατότητα εκτός από ποιοτική εκτίμηση να κάνει και ποσοτική εκτίμηση του προς ανάλυση στόχου. Με χρήση ειδικών αλγορίθμων η αρχική ανίχνευση του φθορισμού ανάγεται σε αντίγραφα του γονιδίου στόχου στο αρχικό δείγμα. Η δυνατότητα της ποσοτικής εκτίμησης, σε συνδυασμό με τις υψηλές ευαισθησίες που επιτυγχάνει (10-4 έως 10-5), την καθιστά ως κατάλληλη τεχνική για παρακολούθηση υπολειμματικής νόσου στις περιπτώσεις που υπάρχει γνωστός βιοδείκτης.

Αλληλούχιση κατά Sanger 

Με την αλληλούχιση κατά Sanger είναι δυνατή η ανίχνευση αλλαγών στην αλληλουχία του DNA μελετώντας κάθε φορά ένα τμήμα ενός γονιδίου.

Για την εκτέλεση της αλληλούχισης απαιτείται μία αρχική PCR για την ενίσχυση του προς μελέτη γονιδίου στόχου. Στη συνέχεια το προϊόν προς αλληλούχιση υποβάλλεται σε περαιτέρω ενίσχυση με χρήση σημασμένων νουκλεοτίδιων με γνωστό φθοριόχρωμα για την κάθε βάση. Τα τελικά προϊόντα υποβάλλονται σε τριχοειδική ηλεκτροφόρηση σε αυτόματους αναλυτές αλληλουχίας. Στο τέλος της ηλεκτροφόρησης το κάθε φθοροσημασμένο προϊόν DNA περνάει από το σύστημα ανίχνευσης, που αναγνωρίζει τις χρωστικές (και κατα συνέπεια τις βάσεις) που φέρει κάθε προϊόν. Τα αποτελέσματα δίνονται σε μορφή χρωματογραφήματος και μετατρέπονται σε νουκλεοτιδικές αλληλουχίες που αντιστοιχούν στην περιοχή προς μελέτη.

Στη συνέχεια οι αλληλουχίες των γονιδίων στόχων συγκρίνονται με τις γενωμικές αλληλουχίες των αντίστοιχων περιοχών και εντοπίζονται πιθανές παραλλαγές που αφορούν αντικαταστάσεις νουκλεοτιδίων, ενθέσεις ή ελλείψεις περιοχών. Τα ευρήματα διασταυρώνονται με επίσημες βάσεις δεδομένων ως προς τη συχνότητα και την βαρύτητα της παραλλαγής που εντοπίστηκε. Αναλόγως των κατευθυντήριων οδηγιών δίνεται και η αντίστοιχη απάντηση. 

Αλληλουχία επόμενης γενιάς (Next Generation Sequencing-NGS)

Τα διαρκώς ανανεωμένα δεδομένα σχετικά με τους μοριακούς βιοδείκτες στην εποχή της ιατρικής ακριβείας θέτουν μεγάλες προκλήσεις στην αιματολογική διάγνωση. Με την εισαγωγή των σύγχρονων μεθόδων μαζικής αλληλούχισης (Next Generation Sequencing), εκατοντάδες χιλιάδες περιοχές γονιδιώματος μπορούν πλέον να αναλυθούν παράλληλα, μέσα σε πολύ σύντομο χρονικό διάστημα και με πολύ υψηλή ευαισθησία. Αυτό ανοίγει νέες δυνατότητες για την ανάλυση μεταλλάξεων και για την παρακολούθηση της εξέλιξης των αιμοποιητικών νεοπλασμάτων. Το NGS χρησιμοποιείται ήδη για τη δημιουργία γενετικών προφίλ για την ταξινόμηση των ΟΜΛ και ΜΔΣ αλλά και για την αλλά και για την ανίχνευση υποκλώνων TP53 στις ΧΛΛ.

Ανάλυση κλωνικότητας

Η ανάλυση κλωνικότητας είναι μια μοριακή διαγνωστική μέθοδος για την ανίχνευση λεμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων. Η τεχνική βασίζεται στην ανίχνευση της αναδιάταξης των γονιδίων V-(D)-J, που φυσιολογικά συμβαίνει κατά τη φάση ωρίμανσης των Β και Τ λεμφοκυττάρων και κωδικοποιεί για τους υποδοχείς αντιγόνων. Σε μια υγιή λεμφική αιμοποίηση ανιχνεύεται ένα πολυκλωνικός πληθυσμός λεμφικών κυττάρων, καθένας από τους οποίους διαφέρει μεταξύ τους ως προς την εξειδίκευση του αντιγόνου και τη γονιδιωματική αναδιάταξη της περιοχής V-(D)-J. Σε ασθενείς με λεμφοϋπερπλαστικά νοσήματα, η υγιής πολυκλωνική αιμοποίηση εκτοπίζεται και επικαλύπτεται από τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό ενός (μονόκλωνου), δύο (δίκλωνων) ή πολλών (ολιγοκλωνικών) κακοήθων λεμφοκυτταρικών κλώνων. Χρησιμοποιώντας ανάλυση αλληλουχίας βάσεων επόμενης γενιάς (NGS), μπορεί να αναλυθεί το μέγεθος και η συχνότητα των γονιδιωματικών αναδιατάξεων στην περιοχή V-(D)-J του υποδοχέα αντιγόνου και μπορεί να αναγνωριστεί η παρουσία ενός κυρίαρχου κυτταρικού κλώνου εντός του πληθυσμού των λεμφικών κυττάρων. Ωστόσο, δεν είναι δυνατή η διαφορική διάγνωση της αιματολογικής κακοήθειας ενώ απαιτείται συσχέτιση με τα υπόλοιπα κλινικοεργαστηριακά δεδομένα.

Εκτός από τη διάγνωση των λεμφοϋπερπλαστικών νοσημάτων, οι αναλύσεις κλωνικότητας με NGS έχουν ευαισθησία έως 10-4 με 10-5 που επιτρέπουν την παρακολούθηση  ελάχιστης υπολειπόμενης νόσου (MRD) με μετρήσιμο τρόπο, βασιζόμενες στον ειδικό για τον ασθενή κλώνο της διάγνωσης.