ΥΛΙΚΟ: Μυελός των οστών. Αν δεν μπορεί να ληφθεί δείγμα μυελού, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και περιφερικό αίμα.

 ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ: 2.5 - 4 ml μυελού των οστών σε σωληνάριο με αντιπηκτικό ηπαρίνη (sodium heparin) (πράσινο πώμα) ή EDTA (μωβ) . Ήπια ανακίνηση για αποφυγή σχηματισμού πήγματος. Αποστολή στο εργαστήριο εντός 24 ωρών από τη λήψη του δείγματος. Αποθήκευση και μεταφορά σε θερμοκρασία δωματίου.

 ΧΡΟΝΟΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗΣ: 3-5 εργάσιμες

Η κλασική κυτταρογενετική ανάλυση αποτελεί τη βασική μέθοδο ταυτοποίησης των κλωνικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών στις αιματολογικές νεοπλασίες. Όμως, η ανάγκη για διαιρούμενα κύτταρα, η απουσία ή κακή μορφολογία μεταφάσεων και η μικρή διακριτική ικανότητα (ανίχνευση χρωμοσωμικών ανωμαλιών μεγέθους > 10Mb), αποτελούν περιοριστικούς παράγοντες για την ολοκληρωμένη και ακριβή μελέτη των χρωμοσωμάτων.

Η τεχνική του Φθορίζοντος in situ Υβριδισμού (Fluorescence in situ Hybridization, FISH) αποτελεί μια μέθοδο μοριακής κυτταρογενετικής, η οποία παρακάμπτει τους περιορισμούς της κλασικής Κυτταρογενετικής. Η τεχνική FISH είναι γρήγορη, ευαίσθητη, μπορεί να εφαρμοστεί είτε σε μεταφασικά χρωμοσώματα (Metaphase FISH – διαιρούμενα κύτταρα), είτε σε μεσοφασικούς πυρήνες (Interphase FISH – μη διαιρούμενα κύτταρα) και μπορεί να ανιχνεύσει μικρού μεγέθους χρωμοσωμικές ανωμαλίες, μη ορατές με τον κλασικό καρυότυπο. Βασικό της μειονέκτημα είναι ότι μελετάει μόνο την χρωμοσωμική περιοχή που στοχεύει ο ιχνηθέτης (probe).

Στις αιματολογικές νεοπλασίες, η μέθοδος FISH χρησιμοποιείται ως συμπληρωματικό εργαλείο του κλασικού καρυοτύπου, τόσο για την αρχική διάγνωση, όσο και κατά την παρακολούθηση της νόσου. Η ανάλυση με FISH μπορεί να ανιχνεύσει ειδικές χρωμοσωμικές αλλοιώσεις, όπως υβριδικά γονίδια, υπομικροσκοπικές αλλοιώσεις, αναδιατάξεις γονιδίων και πιο σύνθετες ανωμαλίες.

ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ

Η τεχνική FISH βασίζεται στον υβριδισμό, μετά από ειδική επεξεργασία, μιας DNA αλληλουχίας - στόχου που βρίσκεται επιστρωμένη σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα και ενός ειδικά σημασμένου με φθορίζουσες ουσίες μοριακού ιχνηθέτη, ο οποίος έχει συμπληρωματική DNA αλληλουχία ως προς την αλληλουχία – στόχο. Υπάρχουν διάφοροι τύποι ιχνηθετών, ανάλογα με την χρωμοσωμική περιοχή - στόχο: οι ειδικοί για μια περιοχή (locus specific), οι ειδικοί για περιοχές με επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (repetitive sequence) και αυτοί που βάφουν ολόκληρο το χρωμόσωμα (whole-chromosome painting).

Η ανάλυση και η αξιολόγηση των παρασκευασμάτων γίνεται σε περιβάλλον μειωμένου φωτισμού, με τη χρήση μικροσκοπίου φθορισμού, εξοπλισμένου με κατάλληλο λογισμικό (Isys, Metasystems, Germany), όπου οι σημασμένες χρωμοσωμικές περιοχές παρατηρούνται ως φθορίζοντα σήματα. Για κάθε ιχνηθέτη, γίνεται καταμέτρηση 200 μεσοφασικών πυρήνων και συντάσσεται η έκθεση αποτελεσμάτων μοριακής κυτταρογενετικής ανάλυσης, στην οποία η περιγραφή των ανωμαλιών γίνεται σύμφωνα με το Διεθνές Σύστημα Ονοματολογίας ISCN 2020 (International System for Human Cytogenomic Nomenclature 2020).

Το Διεθνές Σύστημα Ονοματολογίας ISCN 2020 αποτελεί το κοινό αλφάβητο των Κυτταρογενετιστών και περιέχει όλες τις κατευθυντήριες οδηγίες για την ακριβή περιγραφή όλων των αριθμητικών και δομικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών. Για την τεχνική FISH, η περιγραφή του αποτελέσματος ξεκινάει με “ish” από το in situ hybridization, και στην περίπτωση ανάλυσης μεσοφασικών πυρήνων, τα ευρήματα ξεκινούν με “nuc ish” που αντιστοιχεί σε “nuclear in situ hybridization”. Ακολουθεί ο ιχνηθέτης που χρησιμοποιήθηκε και η χρωμοσωμική θέση στην οποία εδράζεται, καθώς και ο αριθμός των φθοριζόντων σημάτων που παρατηρήθηκαν. Για παράδειγμα, η περίπτωση φυσιολογικού αποτελέσματος του ιχνηθέτη για το κεντρομερίδιο του χρωμοσώματος 8 (2 φθορίζοντα σήματα σε κάθε κυτταρικό πυρήνα) περιγράφεται με το ISCN ως “nuc ish (D8Z2x2), ενώ η περίπτωση τρισωμίας 8 (3 φθορίζοντα σήματα σε κάθε πυρήνα), περιγράφεται ως “nuc ish (D8Z2x3).

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ FISH

ΝΕΟΠΛΑΣΙΕΣ ΑΠΟ Β ΩΡΙΜΑ ΚΥΤΤΑΡΑ

Σετ ιχνηθετων: TP53/ATM,
del(13)(q14.3)/del(13)(q34)/12cen

17cen/17p13.1, -17/del(17p), TP53 έλλειψη

IGH-CCND1, t(11;14)(q13;q32), μετάθεση

IGH-BCL2, t(14;18)(q32;q21), μετάθεση

BCL2, (18q21), αναδιάταξη

MYC/IGH t(8;14)(q24;q32), μετάθεση

del(6)(q21q22.1)/del(6)(q23.3q25),
 SEC63/MYB, έλλειψη

c-MYC (8q24), γονιδιακή ενίσχυση, αναδιάταξη

IGH/MALT1, t(14;18)(q32;q21), μετάθεση

BIRC3/MALT1, t(11;18)(q21;q21), μετάθεση

MALT (18q21), αναδιάταξη

ALK (2p23), αναδιάταξη

BCL6 (3q27.3), αναδιάταξη

IGK (2p11.2), αναδιάταξη

IGL (22q11.21-q11.23), αναδιάταξη

MYB (6q21/6q23), έλλειψη

ΠΛΑΣΜΑΤΟΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΔΥΣΚΡΑΣΙΕΣ

Σετ ιχνηθετών για ανίχνευση υπερδοπλοειδίας/
υποδιπλοειδίας: LSID5S23/D5S721, CEP9, CEP15

MAF/IGH, t(14;16)(q32;q23), μετάθεση

MYEOV/IGH, t(11;14)(q13;q32), μετάθεση

FGFR3/IGH, t(4;14)(p16;q32), μετάθεση

MAFB/IGH, t(14;20)(q32;q12), μετάθεση

IGH (14q32), αναδιάταξη

17cen/17p13.1, -17/del(17p), TP53 έλλειψη

1q21/SRD(1p36), γονιδιακή ενίσχυση/έλλειψη

del(13)(q14)/13q34, έλλειψη 13q14,
 μονοσωμία 13

ΧΡΟΝΙΑ ΜΥΕΛΟΓΕΝΗΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ

BCR-ABL1, t(9;22)(p34;q11.2), μετάθεση Ph+

8cen/c-myc, τρισωμία 8

ΜΥΕΛΟΫΠΕΡΠΛΑΣΤΙΚΑ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΑ

BCR-ABL, t(9;22)(p34;q11.2), μετάθεση

PDGFRB(5q32-q33), αναδιάταξη

FIP1L1/CHIC2/PDGFRA (4q12), αναδιατάξεις, έλλειψη

FGFR1 (8p11-12) αναδιάταξη

ΜΥΕΛΟΔΥΣΠΛΑΣΤΙΚΑ ΣΥΝΔΡΟΜΑ

del(5)(q31)/del(5)(q33), EGR1/RPS14/CSF1R/-5

5q31, EGR1/RPS14,del(5)(q31)/-5

del(7)(q22q31), del(7)(q22)/del(7)(q31)/-7

del(20)(q11.2-q13.3) PTPRT/MYBL2, έλλειψη

TP53 (17p13)/SE 17, i(17q)

ETV6, 12p13, del(12p), έλλειψη

MECOM, inv(3)(q21q26), t(3;3)(q21;q26), t(3q)

8cen/c-myc, τρισωμία 8

ΟΞΕΙΑ ΜΥΕΛΟΓΕΝΗΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ

PML/RARA, t(15;17)(q22;q21.2), μετάθεση

RARA (17q22), αναδιάταξη

t(8;21)(q22;q22), RUNX1/RUNX1T1

ETV6(12p13), αναδιάταξη

inv(16)(p13;q22), t(16;16), CBFB/MYH11

MLL, t(11q12;var), αναδιάταξη

MECOM, inv(3)(q21q26), t(3;3)(q21;q26), t(3q)

del(5)(q31)/del(5)q(33), ERG1/RPS14/CSF1R/-5

del(7)(q22q31), del(7)(q22)/del(7)(q31)/-7

17cen/17p13.1, -17/del(17p), TP53 έλλειψη

DEK/NUP214, t(6;9)(p22;q34), μετάθεση

Β-ΟΞΕΙΑ ΛΕΜΦΟΒΛΑΣΤΙΚΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ

ETV6/RUNX1 t(12;21) (p13;q22), μετάθεση

ETV6 (12p13), αναδιάταξη

MLL, t(11q23;var), αναδιάταξη

MLL/AFF1, t(4;11)(q21;q23), μετάθεση

BCR-ABL1, t(9;22)(p34;q11.2), μετάθεση

TCF3-PBX1, t(1;19)(q23;p13.3), μετάθεση

9cen/CDKN2A, del(9p21), έλλειψη

CRLF2 (Xp22/Yp11)/IGH(14q32), μετάθεση

dic(9;20)(p13.2;q11.2)

Σετ ιχνηθετών για ανίχνευση υπερδιπλοειδίας/
υποδιπλοειδίας XCE4/10/17

Τ-ΛΕΜΦΟΒΛΑΣΤΙΚΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ / Τ-ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ

TCRA/D (14q11.2), αναδιάταξη

TCRB (TRB)(7q34), αναδιάταξη

TLX1 (10q24.34), αναδιάταξη

TLX3 (5q35.1), αναδιάταξη

ALK (2p23), αναδιάταξη