Μεθοδος

Αντιπηκτικό

Αναγκαιότητα

Ανοσοφαινότυπος

EDTA/Heparin

Υποχρεωτικός

Καρυοτυπική Ανάλυση

Heparin

Υποχρεωτική

FISH

EDTA

Υποχρεωτική

Μοριακές

EDTA/Heparin

Υποχρεωτικές

ALL: Ταξινόμηση

Σύμφωνα με την ταξινόμηση της WHO, η ALL, μαζί με το λεμφοβλαστικό λέμφωμα, αποτελούν πρόδρομα νεοπλάσματα των Β- ή Τ- κυττάρων, με την ανίχνευση άνω του 25% βλαστών στον μυελό των οστών να διαφοροποιεί την ALL από το λεμφοβλαστικό λέμφωμα (Swerd et al. 2017). Η ταξινόμηση σε υποομάδες (Εικόνα 1) βασίζεται κυρίως σε κυτταρογενετικά και μοριακά κριτήρια (Alaggio et al. 2022). Κλινικά σημαντική είναι και η ανοσοφαινοτυπική ταξινόμηση σύμφωνα με το EGIL, η οποία αποτελεί τη βάση για την ταξινόμηση των ανοσολογικών υποτύπων από την ομάδα μελέτης GMALL, οι οποίοι σχετίζονται με συγκεκριμένες κλινικές και κυτταρογενετικές ανωμαλίες.

 all-whoclassification-fig1-1600x-q99.jpg

Εικόνα. 1: Ταξινόμηση της ALL σύμφωνα με τη WHO (Alaggio et al. 2022) και το GMALL/EGIL. B-ALL (Β-λεμφοβλαστική λευχαιμία/λέμφωμα) και T-ALL (Τ-λεμφοβλαστική λευχαιμία/λέμφωμα).

B-ALL

Ανοσοφαινότυπος στη B-ALL

Ο ανοσοφαινότυπος επιτρέπει την κατηγοριοποίηση των ALL στη Β- ή Τ-κυτταρική σειρά και τον προσδιορισμό του βαθμού διαφοροποίησης, στον οποίο βασίζεται η ταξινόμηση EGIL (Πίνακας 1). Η διαγνωστική επιβεβαίωση του ανοσοφαινοτυπικού υποτύπου έχει κλινική σημασία στη διαστρωμάτωση κινδύνου των ασθενών και στη λήψη θεραπευτικών αποφάσεων. Επιπλέον, ο ανοσοφαινότυπος χρησιμοποιείται για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας της θεραπείας με τον προσδιορισμό της μετρήσιμης υπολειπόμενης νόσου (MRD), ειδικά επί απουσίας μοριακών δεικτών.

Πίνακας 1: Ταξινόμηση της Β-ALL σύμφωνα με το EGIL

 

B-precursor-ALL

   

Antigen

Pro-B-ALL

c-ALL

Pre-B-ALL

cCD22*

+

+

+

CD79a

+

+

+

CD19

+

+

+

CD24

+/-

+

+

CD20

-/(+)

+/-

+/-

slg*

-

-

-

CD20

-

-/+

-/+

CD10

-

+

+/-

HLA-DR

+

+

+

CD34

+

+

-

*c: cytoplasmic; s: "surface", membrane-bound

Χρωμοσωμική ανάλυση στη B-ALL

Ο καρυότυπος είναι απαραίτητος στην ταξινόμηση του νοσήματος σύμφωνα με τη WHO. Ωστόσο, η προγνωστική σημασία των κυτταρογενετικών ευρημάτων είναι ακόμη πιο σημαντική (Πίνακες 2, 3).

Ειδικότερα, η αντιμετάθεση t(9;22) ή t(4;11), που ορίζονται ως δυσμενείς προγνωστικοί παράγοντες στην ομάδα μελέτης GMALL, επηρεάζουν τη θεραπευτική στρατηγική στη B-ALL. Οι ασθενείς με υποδιπλοειδία έχουν επίσης δυσμενή πρόγνωση, ενώ η υπερδιπλοειδική ALL σχετίζεται με καλή πρόγνωση.

Πίνακας 2: Επαναλαμβανόμενες χρωμοσωμικές ανωμαλίες στην ALL ενηλίκων

Chromosomal aberration

Phenotype

Genes

Frequency

Prognosis

t(1;19)(q23;p13)

Pre-B-ALL

TCF3::PBX1

3%

Δυσμενής *

t(4;11)(q21;q23)

Pro-B-ALL

KMT2A::AFF1 (MLL-AF4)

6%

Δυσμενής

t(6;11)(q27;q23)

B-ALL

KMT2A::MLLT4

< 1%

Δυσμενής

t(8;14)(q11;q32)

Pre-B-ALL

IGH::CEBPD

< 1%

Δυσμενής

t(9;11)(p21;q23)

Pro-, Pre-B-ALL

KMT2A::MLLT3

< 1%

Δυσμενής

t(9;22)(q34;q11)

c-ALL

BCR::ABL1

25-30%

Δυσμενής

10p12/11q23

Pro-, Pre-B

KMT2A::MLLT10

< 1%

Δυσμενής

t(11;19)(q23;p13)

Pro-, Pre-B-ALL

KMT2A::MLLT1

1%

Δυσμενής

t(12;21)(p13;q22)

Pre-B-ALL

ETV6::RUNX1

< 1%

Ευνοϊκή

t(14;14)(q11;q32)

Pre-B-ALL

IGH::CEBPE

< 1%

Δυσμενής

t(14;19)(q32;q13)

Pre-B-ALL

IGH::CEBPA

< 1%

Δυσμενής

t(14;20)(q32;q13)

Pre-B-ALL

IGH::CEBPB

< 1%

Δυσμενής

t(17;19)(q22;p13)

Pre-B-ALL

TCF3::HLF

< 1%

Δυσμενής

9p

Pre-B-ALL

CDKN2A

15%

-          

* βελτίωση μέσω πιο εντατικής θεραπείας

Πίνακας 3: Αριθμητικές Χρωμοσωμικές Ανωμαλίες στην ALL (σύμφωνα με τους Heim & Mitelman 2015)

Ploidy group

Chromosome number

Phenotype

near haploidy

25-29

c-, Pre-B-ALL

low hypodiploidy

30-39

c-, Pre-B-ALL

high hypodiploidy

42-45

B-ALL

high hyperdiploidy

51-65

c-, Pre-B-ALL

Οι high hyperdiploid ALL δείχνουν ένα χαρακτηριστικό μοτίβο απόκτησης των χρωμοσωμάτων 4, 6, 10, 14, 17, 18 και 21 και του χρωμοσώματος Χ. Οι ασθενείς με low hypodiploid καρυότυπο παρουσιάζουν συνήθως απώλειες των χρωμοσωμάτων 3, 7, 13, 15, 16 και 17.

Fluorescence in situ hybridization (FISH) στη B-ALL

H FISH χρησιμοποιείται συχνά, πλέον της κλασσικής χρωμοσωμικής ανάλυσης, για την επιβεβαίωση ανιχνευόμενων ανωμαλιών και για τη δημιουργία μιας βάσης για την ανίχνευση υπολειπόμενης νόσου μετά από θεραπεία.

Μοριακά ευρήματα στη B-ALL

Η μοριακή γενετική (Πίνακας 4) επιτρέπει, μεταξύ άλλων, τον εντοπισμό ομάδων υψηλού κινδύνου που φέρουν την αντιμετάθεση t(9;22)(q34;q11) ή t(4;11)(q21;q23) με ανίχνευση του αντίστοιχου υβριδικού μεταγράφου BCR::ABL1 or KMT2A::AFF1 (προηγούμενα: MLL::AF4).

Πίνακας 4: Κοινά επαναλαμβανόμενα υβριδικά γονίδια στη B-precursor ALL

Cytogenetic

Fusion gene

Subtype

Frequency

 

Children

Adults

t(1;19)(q23;p13)

TCF3::PBX1

Pre-B-ALL

5-6%

3%

t(4;11)(q21;q23)

KMT2A::AFF1
(MLL::AF4)

Pro-B-ALL

2%

6%

t(11;19)(q23;p13)

KMT2A::MLLT1

Pro-B-ALL, Pre-T-ALL

< 1%

< 1%

t(9;22)(q34;q11)

BCR::ABL1

c-, Pre-B-ALL

2-5%

25-30%

t(12;21)(p13;q22)

ETV6::RUNX1

c-ALL

10-20%

< 1%

Επιπροσθέτως, η τρανσκριπτωμική ανάλυση (RNA-Seq) μπορεί να χρησιμοποιηθεί στον χαρακτηρισμό του προφίλ γονιδιακής έκφρασης, όπως στην περίπτωση της BCR::ABL1-like υποομάδας, επιτρέποντας την ταυτοποίηση πιθανών θεραπευτικών στόχων.

Άνω των 60% των BCR::ABL1-θετικών B-precursor ALL ή BCR::ABL1-like ALL έχουν συγχρόνως έλλειψη του  IKZF1 γονιδίου, οδηγώντας σε ακόμη δυσμενέστερη πρόγνωση (Mullighan et al. 2008, Martinelli et al. 2009, van der Veer et al. 2014). Ένας επιπρόσθετος δυσμενής προγνωστικός παράγοντας, ειδικά όταν επηρεάζονται και τα δύο αλλήλια, είναι οι μεταλλάξεις του  TP53 γονιδίου. Αυτές παρατηρούνται συχνότερα στη low hypodiploid ALL ή σε MYC αναδιατάξεις (Stengel et al. 2014).

T-ALL: Διαγνωστικές μέθοδοι και συσχέτισή τους

Ανοσοφαινότυπος στην T-ALL

Με τη βοήθεια του ανοσοφαινοτύπου η ALL ταξινομείται στη Β- ή Τ-κυτταρική σειρά και προσδιορίζεται ο βαθμός διαφοροποίησης. Αυτή είναι και η βάση της EGIL ταξινόμησης. (Πίνακας 5).

Η επιβεβαίωση της διάγνωσης του ανοσοφαινοτυπικού υποτύπου επιπλέον έχει κλινική σημασία στη διαστρωμάτωση κινδύνου των ασθενών, καθώς και στη λήψη θεραπευτικών αποφάσεων.

Η ανάλυση αυτή χρησιμοποιείται επίσης ως έλεγχος αποτελεσματικότητας της θεραπείας με τον προσδιορισμό της μετρήσιμης υπολειπόμενης νόσου, ειδικά επί απουσίας μοριακών δεικτών.

Πίνακας 5: Ανοσοφαινοτυπική ταξινόμηση της T-precursor ALL σύμφωνα με το EGIL

T-precursor ALL

 

Pro-T-ALL

cCD3*, CD7, (CD10), (HLA-DR), (CD34), (TdT)

Pre-T-ALL

cCD3*, CD7, CD2 or CD5 (in >75% of blasts and highly expressed), CD4-CD8- or CD4+CD8+ (“double negative” or “double positive”), (CD10), (HLA-DR), (CD34), TdT

Cortical T-ALL

cCD3*, (sCD3*), CD7, CD5, CD2, CD1a, CD4+CD8+, (CD10), TdT

Mature T-ALL

sCD3*, CD7, CD5, CD2, CD4 oder CD8, (TdT)

ETP-ALL

CD7, CD8-, CD1a-, CD5 (<75% of blasts and weakly expressed), CD34**, KIT**, HLA-DR**, CD13**, CD33**, CD11b**, CD65**

     

*c: cytoplasmic, detectable inside the cell; s: "surface", detectable on the cell surface; ** often positive for one or more myeloid markers/stem cell markers

Χρωμοσωμική ανάλυση στην T-ALL

Η T-ALL εμφανίζεται με συχνότητα 15% στην παιδική ALL και 25% σε ενήλικες ασθενείς με ALL και χαρακτηριστικά επηρεάζει τους άνδρες συχνότερα από τις γυναίκες. Οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες μπορούν να ανιχνευθούν στο 50-70% των ασθενών με Τ- ALL. Οι πιο συνηθισμένες κυτταρογενετικές ανωμαλίες αποτελούν μετατοπίσεις που σχετίζονται με ανώμαλη έκφραση ογκογόνων μεταγραφικών παραγόντων. Με βάση το εμπλεκόμενο ογκογονίδιο, η T-ALL μπορεί να ταξινομηθεί σε μοριακές υποομάδες (Πίνακας 6). Επιπλέον, εκτός από τις κοινές μεταβολές του αριθμού των αντιγράφων, όπως έλλειψη 9p (65-70%) και 6q (20-30%), παρατηρούνται και άλλες επαναλαμβανόμενες ανωμαλίες που δεν είναι ειδικές για την υποομάδα (Πίνακας 7).

Πίνακας 6: Επαναλαμβανόμενες χρωμοσωμικές ανωμαλίες στην T-ALL που καθορίζουν υποομάδες

Molecular subtype

Chromosomal aberration

Genes

Frequency

TLX1

t(10;14)(q24;q11)

TLX1::TRAD

5-10%

TLX1

t(7;10)(q34;q24)

TRB::TLX1

<1%

TLX3

t(5;14)(q35;q32)

TLX3::BCL11B

20% (children), rare in adults

TAL1

t(1;14)(p32;q11)

TRAD::TAL1

3%

TAL1

del(1p32)

STIL::TAL1

9-26%

HOXA

inv(7)(p15q34)

HOXA::TRB

3%

HOXA

del(9)(q34q34)/t(9;9)(q34;q34)

SET::NUP214

rare

HOXA

9q34/Episomal amplification

NUP214::ABL1

5%

HOXA

t(10;11)(p12;q14)

PICALM::MLLT10

5%

HOXA

t(X;10)(p11;p12)

DDX3X::MLLT10

3%

HOXA

t(4;11)(q23;p15)

NUP98::RAP1GDS1

rare

BCL11B*

BCL11B/14q32 rearrangements (frequent partners: 8q24 or 6q25)

 

<5%

*also in MPAL and undifferentiated AML

Πίνακας 7: Περαιτέρω επαναλαμβανόμενες χρωμοσωμικές ανωμαλίες στην T-ALL

Chromosomal aberration

Genes

Frequency

KMT2A rearrangements

KMT2A::MLLT1 (most often), ELLMLLT10AFDN

8%

t(9;12)(q34;p13)

ETV6::ABL1

rare

t(11;14)(p15;q11)

TRAD::LMO1

rare

t(11;14)(p13;q11)

TRAD::LMO2

rare

t(7;9)(q34;q34)

TRB::NOTCH1

rare

t(4;14)(q25;q11)

TRAD::LEF1

rare

t(6;7)(q23;q34)

TCRB::MYB

rare

Fluorescence in situ hybridization (FISH) σε Τ-ALL

Η FISH χρησιμοποιείται συχνά εκτός από την κλασσική χρωμοσωμική ανάλυση για την επιβεβαίωση των ανωμαλιών που ανιχνεύονται με την τελευταία.

Μοριακά ευρήματα στην T-ALL

Οι μοριακές γενετικές αναλύσεις μπορούν να ανιχνεύσουν υβριδικά γονίδια που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της T-ALL (Πίνακας 8).

Πίνακας 8: Συχνά επαναλαμβανόμενα υβριδικά γονίδια στην T-ALL

Cytogenetic

Fusion gene

Frequency

1p32 deletion

STIL::TAL1

9%-26%

del(9)(q34q34)/t(9;9)(q34;q34)

SET::NUP214

rare

9q34/Episomal amplification

NUP214::ABL1

5%

t(10;11)(p12;q14)

PICALM::MLLT10

5%

Επιπλέον, στην T-ALL συμβαίνουν μεταλλάξεις σε διάφορα γονίδια. Αυτές περιλαμβάνουν μεταλλάξεις ενεργοποίησης στο γονίδιο NOTCH1 σε πάνω από 50% των περιπτώσεων T-ALL και μεταλλάξεις στο γονίδιο FBXW7 σε περίπου 20% των περιπτώσεων. Οι μεταλλάξεις στο γονίδιο FBXW7 συμβάλλουν στην ενεργοποίηση του γονιδίου NOTCH1. Η απουσία μιας μετάλλαξης NOTCH1/FBXW7 ή/και η παρουσία μιας μετάλλαξης στα γονίδια PTEN (6-10%) και N-/K-RAS έχουν περιγραφεί ως χαρακτηριστικά υψηλού κινδύνου (Trinquand et al. 2013).

Μελέτη μετρήσιμης υπολειπόμενης νόσου (MRD)

Η MRD κατά τη διάρκεια και μετά τη θεραπεία επηρεάζει την Event-Free Survival (EFS) και τη συνολική επιβίωση (OS) (Brueggemann et al. 2006, Berry et al. 2017, O'Connor et al. 2017).  Η MRD είναι ένας εξαιρετικά σημαντικός προγνωστικός παράγοντας και επιτρέπει την έγκαιρη ανίχνευση της υποτροπής. Με βάση αυτό γίνεται η ταχεία προσαρμογή της θεραπευτικής στρατηγικής. Η ποσοτικοποίηση της MRD μπορεί να πραγματοποιηθεί τόσο με μοριακές μεθόδους όσο και με ανοσοφαινότυπο.