ΥΛΙΚΟ: Μυελός των οστών. Αν δεν μπορεί να ληφθεί δείγμα μυελού και αν υπάρχει σημαντικός αριθμός βλαστών μπορεί να χρησιμοποηθεί και περιφερικό αίμα.
ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ: 2.5 – 4 ml μυελού των οστών σε σωληνάριο με αντιπηκτικό ηπαρίνη (sodium heparin) (πράσινο πώμα). Ήπια ανακίνηση για αποφυγή σχηματισμού πήγματος. Αποστολή στο εργαστήριο εντός 24 ωρών από τη λήψη του δείγματος. Αποθήκευση και μεταφορά σε θερμοκρασία δωματίου.
ΧΡΟΝΟΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗΣ: 10 ΕΡΓΑΣΙΜΕΣ ΗΜΕΡΕΣ
Το γενετικό υλικό (DNA) οργανώνεται στον πυρήνα των κυττάρων με τη μορφή των χρωμοσωμάτων. Ο φυσιολογικός αριθμός των χρωμοσωμάτων στα ανθρώπινα κύτταρα είναι 46, κατανεμημένα σε 23 ζεύγη (22 αυτοσωμικά και 1 φυλετικό).
Η κλασική κυτταρογενετική ανάλυση (καρυότυπος), είναι η μελέτη των χρωμοσωμάτων των κυττάρων με σκοπό να ανιχνευτούν και να προσδιοριστούν οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Υπάρχουν δύο τύποι χρωμοσωμικών ανωμαλιών: οι αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες, αφορούν αλλαγές στον αριθμό των χρωμοσωμάτων και οι δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες, αφορούν αλλαγές στη δομή τους. Οι αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες διακρίνονται στις ανευπλοειδίες, όπου υπάρχει ένα επιπλέον (τρισωμία) ή ένα λιγότερο (μονοσωμία) χρωμόσωμα και στις πολυπλοειδίες, όπως η τριπλοειδία και η τετραπλοειδία, όπου παρατηρείται τριπλάσιος (69,ΧΧΧ ή 69,ΧΧΥ) και τετραπλάσιος (92,ΧΧΧΧ ή 92,ΧΧΥΥ) αριθμός ζευγών, αντίστοιχα. Οι δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες διακρίνονται σε ισοζυγισμένες, όταν υπάρχει ισορροπία γενετικού υλικού και σε μη ισοζυγισμένες, όταν υπάρχει απώλεια ή προσθήκη γενετικού υλικού. Οι ισοζυγισμένες δομικές ανωμαλίες είναι οι αμοιβαίες μεταθέσεις (ανταλλαγή τμημάτων χρωμοσώματος μεταξύ δύο διαφορετικών χρωμοσωμάτων) και οι αναστροφές (περιστροφή ενός τμήματος χρωμοσώματος κατά 180°). Στις μη ισοζυγισμένες δομικές ανωμαλίες, ανήκουν οι ελλείψεις ή προσθήκες χρωμοσωμικού υλικού, τα χρωμοσώματα δείκτες, τα δακτυλιοειδή χρωμοσώματα, τα ισοχρωμοσώματα και τα δικεντρικά χρωμοσώματα.
Η κλασική κυτταρογενετική ανάλυση των αιματολογικών νεοπλασμάτων αποτελεί τα τελευταία 50 χρόνια τη βασική μέθοδο ανίχνευσης των κλωνικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών. Οι κλωνικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες παίζουν σημαντικό ρόλο στην κλινική αξιολόγηση των αιματολογικών ασθενών, καθώς η ταυτοποίησή τους παρέχει πληροφορίες για την διάγνωση και ακριβή τυποποίηση της νόσου, την προγνωστική αξιολόγηση, την επιλογή του κατάλληλου θεραπευτικού πρωτοκόλλου και τον έλεγχο του θεραπευτικού αποτελέσματος.
ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ
Για την χρωμοσωμική ανάλυση, τα χρωμοσώματα πρέπει να βρίσκονται στο στάδιο της μετάφασης του κυτταρικού κύκλου. Προκειμένου να μελετηθεί επαρκής αριθμός μεταφάσεων και να αυξηθούν οι πιθανότητες να βρεθούν οι κλωνικές χρωμοσωμικές μεταφάσεις απαιτείται καλλιέργεια του βιολογικού υλικού σε κατάλληλες συνθήκες. Ανάλογα με τη διάγνωση, απαιτούνται διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας των κυττάρων, όπως διαφορετικές βραχυπρόθεσμες καλλιέργειες (24-72 ώρες) και διέγερση με την προσθήκη μιτογόνων παραγόντων, καθώς κάθε καρκινικό κύτταρο έχει διαφορετικό κυτταρικό κύκλο.
Μετά τo πέρας της καλλιέργειας, τα κύτταρα σταματάνε στη μετάφαση της μίτωσης με την προσθήκη κολχικίνης. Ακολουθεί η συγκομιδή των κυττάρων, με την προσθήκη υπότονου διαλύματος χλωριούχου καλίου, τα κύτταρα διογκώνονται, σπάνε οι κυτταρικές μεμβράνες και απελευθερώνονται τα χρωμοσώματα. Τέλος, προστίθεται διάλυμα μεθανόλης/οξικού οξέος για την μονιμοποίηση των χρωμοσωμάτων. Το κυτταρικό εναιώρημα επιστρώνεται σε αντικειμενοφόρους πλάκες και για τον προσδιορισμό των χρωμοσωμάτων και την ανάλυση της δομής τους, γίνεται χρώση των χρωμοσωμικών παρασκευασμάτων με την τεχνική ζώνωσης G (Giemsa banding). Με αυτή τη μέθοδο, κάθε ζεύγος χρωμοσωμάτων χαρακτηρίζεται από ένα συγκεκριμένο πρότυπο σκουρόχρωμων και ανοικτόχρωμων ζωνών (ζώνες G), το οποίο είναι ειδικό για κάθε χρωμόσωμα και επιτρέπει σε κάθε μεμονωμένο χρωμόσωμα να αναγνωρίζεται μοναδικά. Η μικροσκοπική ανάλυση γίνεται σε οπτικό μικροσκόπιο, εξοπλισμένο με κατάλληλο λογισμικό (Ikaros, Metasystems, Germany). Για κάθε ασθενή με αιματολογική κακοήθεια, η κυτταρογενετική ανάλυση θεωρείται πλήρης όταν αναλυθούν τουλάχιστον 20 μεταφάσεις, όταν πρόκειται για αρχική διάγνωση, και τουλάχιστον 25 μεταφάσεις, όταν πρόκειται για ανάλυση μετά από θεραπεία. Για να χαρακτηριστεί μια χρωμοσωμική ανωμαλία κλωνική, πρέπει να ανιχνευτούν τουλάχιστον δύο μεταφάσεις με την ίδια δομική ανωμαλία ή προσθήκη του ίδιου χρωμοσώματος (τρισωμία), ή τουλάχιστον τρεις μεταφάσεις με απώλεια του ίδιου χρωμοσώματος (μονοσωμία). Αφού αναλυθεί ο απαιτούμενος αριθμός κυττάρων, συντάσσεται η έκθεση αποτελεσμάτων κυτταρογενετικής ανάλυσης, στην οποία η περιγραφή του καρυοτύπου γίνεται σύμφωνα με το Διεθνές Σύστημα Ονοματολογίας ISCN 2020 (International System for Human Cytogenomic Nomenclature 2020).
Το Διεθνές Σύστημα Ονοματολογίας ISCN 2020 αποτελεί το κοινό αλφάβητο των Κυτταρογενετιστών και περιέχει όλες τις κατευθυντήριες οδηγίες για την ακριβή περιγραφή όλων των αριθμητικών και δομικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών. Kάθε χρωμόσωμα έχει μία περιοχή περίσφυξης που το χωρίζει σε δύο βραχίονες, τον μικρό βραχίονα (p) και τον μεγάλο βραχίονα (q). Η ταξινόμηση των χρωμοσωμάτων ανά ζεύγη βάσει του μεγέθους, της θέσης του κεντρομεριδίου και του χαρακτηριστικού προτύπου ανοιχτόχρωμων και σκουρόχρωμων ζωνών, ονομάζεται Καρυότυπος. Η περιγραφή του καρυοτύπου ξεκινάει με το συνολικό αριθμό των χρωμοσωμάτων, ακολουθεί σημείο στίξης κόμμα (,) και μετά τα φυλετικά χρωμοσώματα. Επομένως, ο φυσιολογικός καρυότυπος ενός θήλεος ατόμου είναι 46,ΧΧ, και ο φυσιολογικός καρυότυπος ενός άρρενος ατόμου είναι 46,ΧΥ.